哺乳动物蛋白提取试剂盒组成

本试剂盒包含以下组成成分：

• 5X Buffer: 10ml
• 5X NaCl: 10ml
• 5X SDS: 10ml
• 5X DOC: 10ml
• 5X NP-40: 10ml
• 20X PBS: 10ml
• Protease inhibitor cocktail: 0.5ml

保存条件

本试剂盒可在常温下保存，唯一需要在-20°C保存的是Protease inhibitor cocktail，其保质期为24个月。

提取步骤

1. 准备

根据组成比例，将5X Buffer, 5X NaCl, 5X SDS, 5X DOC和5X NP-40以1:1:1:1:1的体积比混合，制备细胞裂解缓冲液。每1ml的细胞裂解缓冲液可用于提取106~107个细胞或5~20mg组织的蛋白质。在使用前，需加入10μl的Protease inhibitor cocktail。

2. 洗涤细胞或组织

a. 贴壁细胞：去除细胞培养基，使用PBS缓冲液冲洗细胞两次。加入细胞裂解缓冲液（106~107个cells/ml），将细胞完全浸入冰袋中，摇床孵育30分钟，期间需多次重悬细胞，最后刮取并收集裂解液。

b. 悬浮细胞：在700xg下离心5分钟后，弃去上清液，使用PBS洗涤细胞两次，并在4°C下离心去除上清液。然后将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液（106~107个cells/ml），再在冰桶中摇床孵育30分钟。

c. 组织：将组织切割成小块，用PBS洗涤两次后，加入细胞裂解缓冲液（5~20mg组织/ml）。将混合物转移到预冷的微量匀浆器中，于冰上均质30~50次，确保均质过程不会影响靶蛋白的功能完整性。使用34°C, 12,000xg离心10分钟以沉淀细胞碎片，或进行高速离心(100,000xg, 45分钟)以制备蛋白质溶液。

3. 收集样品

将含有蛋白质的上清液转移至冷冻管中，样品可在冰上保存以便立即使用，或将蛋白质溶液转存于-70°C保存。