细胞冷冻保存是一种在低温条件下保存细胞的方法，旨在长时间维持细胞的活性和功能。这一技术对细胞系的长期保存、实验的可重复性、基因库的构建以及细胞治疗的储备等方面具有重要的医学意义。通过冷冻保存，可以有效减少细胞在传代过程中的遗传变异，同时避免因污染、环境变化或实验操作失误所导致的细胞损失。冷冻保存的最佳时机是在细胞处于最佳生长阶段时。

冷冻保护剂是细胞冷冻保存中的关键成分，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受机械损伤。DMSO适用于大多数细胞类型，但部分细胞对其敏感，此时可以考虑使用甘油替代。

实验步骤

第1阶段: 冷冻保存

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型等信息（如基因改造等）。
2. 对于贴壁细胞，首先去除培养基，用PBS冲洗，再添加适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并放入37°C的培养箱中孵育约2分钟（具体时间依据细胞类型调整）。随后添加同体积的培养基以终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞，将其转移至50mL的Falcon管中。
3. 对于悬浮培养细胞，将所需体积的细胞直接转移至50mL Falcon管中。
4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定活力，冷冻保存的细胞活力应至少保持在75%以上。
5. 在室温下以300× g离心5分钟，随后去除上清液。
6. 准备冷冻培养基（见表1），并在使用前均匀混合并加热至37°C。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方
细胞类型 - 冻存培养基配方
  在含有FBS的培养基中培养的细胞 - 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
  在无血清培养基中培养的细胞 - 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
  需要甘油冷冻的细胞 - 90%胎牛血清 + 10%甘油

注意，DMSO不适合所有细胞类型，有些情况下需要使用甘油作为替代。

7. 加入冻存培养基至所需细胞密度，通常对于哺乳动物细胞，该浓度为1×106/mL。冻存液中细胞暴露的时间不应超过10分钟。
8. 将1mL样品分装进入冷冻管，并盖紧。
9. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放置于-80°C冰箱中，确保冷却速度以每分钟1°C的速率稳定下降。
10. 约24小时后，将冷冻管从冷冻盒中取出并转移至液氮中进行长期储存。一般来说，冷冻细胞可以在液氮中保存数年，而不应在-80°C下保存超过一周，以免损害细胞活力。

第2阶段: 解冻冷冻细胞系

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C的水浴中，直至约80%解冻（不可在室温下解冻），此过程应控制在1分钟以内。
2. 用移液器将冷冻管中的物质转移至含约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。
3. 以300× g离心5分钟，弃上清液，用适量的培养基重悬细胞沉淀。
4. 将细胞悬液转移至培养容器中，然后置于37°C培养箱中培养。

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