### 培养条件概述

本实验室使用的细胞培养条件为：DMEM培养基，加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S），培养方式为贴壁培养。培养温度设置为37℃。

### 传代策略

首次传代建议采取1:2的比例，经过两天后进行换液处理。为确保细胞健康，建议同步购买俄罗斯专享会284的优惠细胞。在细胞处理后，应将其培养至良好状态，最后添加充分的培养液并密封瓶口，这样是进行细胞运输的最佳办法。

### 消毒与细胞处理

收到细胞后，需用75%酒精对细胞瓶表面进行喷洒消毒。之后应在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置在37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以帮助细胞状态稳定，随后可进行后续处理。

### 显微镜观察

在处理过程中，务必使用显微镜观察细胞的生长情况，并根据不同倍数拍照保存（建议使用40x、100x、200x拍摄各一张）。前三天的图像是重要的售后依据，若不提供照片将默认细胞状态良好。

### 细胞传代步骤

细胞传代：若未超过80%汇合度，将完全培养液收集至离心管中，保留5ml，然后放入37℃、5%CO2孵箱再培养；若细胞密度超过80%，则可直接进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去上清液，使用不含钙、镁的PBS对细胞进行1-2次润洗。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37℃培养箱消化1-2分钟，观察细胞状态，若细胞大部分已变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻轻敲打培养瓶后添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml的离心管中，在1000RPM下离心5分钟，去掉上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按照1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新鲜的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代步骤如下：

1. 进行半换液法处理：将培养瓶竖着放置于培养箱中静置约1小时，轻轻吸去约3ml的培养基后，再补充3ml的完全培养基。若培养基变色缓慢，可以直接添加约500ul FBS。在传代时，可直接补给5ml的培养基，并分装至两个培养瓶中；通常这样操作2-3次后可进行离心操作以去除死细胞。
2. 离心换液法：如需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，去掉上清后补充1-2ml的培养液，重悬混合后，将细胞悬液按1:2的比例分至新T25瓶中，并添加6-8ml的新完全培养基以维持细胞活力，后续传代根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存与复苏

细胞冻存：当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗一次；添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻摇动，观察细胞的变化，待细胞开始回缩并变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

弃去上清后，加入1ml的无血清冻存液（如俄罗斯专享会284的冻存液），混匀后转移至冻存管中。将冻存细胞立即放入-80℃冰箱保存，如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

细胞复苏：从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），快速置入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶，然后使用75%的酒精擦拭冻存管的外壁。随后，将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；弃去上清，将细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5%CO2的培养箱继续培养。第二天，换用新鲜的完全培养基进行继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能因粘附不牢而发生脱落，这属于正常现象。如脱离的细胞较多，建议将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清用于过渡培养（后期可进行对比培养），沉淀的细胞加入1-2ml的胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基以终止反应。再进行离心，弃去上清，重悬于1-2ml完全培养基中，并按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。